中国添加新冠肺炎灭活疫苗:由高福等学者领衔，高效安全
本报记者何丽萍
新冠肺炎大流行威胁全球公共卫生。为了预防和控制新冠肺炎疫情，人类迫切需要疫苗。中国研究小组研制的新冠肺炎灭活疫苗bbibp-corv，在动物实验中显示出巨大的潜力:该疫苗高效、安全，可在小鼠、大鼠、豚鼠、兔和非人灵长类(食蟹猴和恒河猴)中诱导高水平的中和抗体滴度，2 & muG/剂量可以提供有效的抗SARS-CoV-2保护。同时，候选疫苗是我国研制的第二种重要灭活疫苗，增加了我国候选疫苗的选择。
上述结果来自于国际权威学术期刊《细胞》于当地时间6月6日在网上发表的一篇重磅论文:“一种具有抗sars-cov-2保护能力的体内活化候选疫苗bbibp-corv的研制”
本文作者是中国科学院院士、中国疾病预防控制中心主任高福；中国医学科学院医学实验动物研究所所长秦川；谭，中国疾病预防控制中心病毒性疾病研究所应急技术中心主任；楼志勇，清华大学教授；中国食品药品监督管理局研究院研究员李长贵；吴，生物安全首席专家，中国疾病预防控制中心党组书记。
【/h/】研究团队来自北京生物制品有限公司研究所、中国疾病预防控制中心传染病防治研究所、国家人类疾病动物模型资源中心、国家健康与福利委员会人类疾病比较医学重点实验室、中国医学科学院医学实验动物研究所、北京协和医学院比较医学中心、清华大学新发和复发性传染病动物模型研究北京重点实验室等。
研究人员详细介绍了sars-cov-2灭活候选疫苗(bbibp-corv)的实验性生产，该疫苗可在小鼠、大鼠、豚鼠、兔和非人灵长类动物(食蟹猴和恒河猴)中诱导高中和抗体滴度，以保护sars-cov-2。在恒河猴的气管内免疫中，研究使用了2μ；G/剂量的bbibp-corv可提供高效的抗sars-cov-2保护，但未检测到抗体依赖性增强(ade)感染。此外，bbibp-corv在疫苗生产中表现出高生产率和良好的遗传稳定性。
与sars-cov和mers-cov相比，sars-cov-2的传播速度似乎更快，因此急需疫苗。到目前为止，已经报道了三种候选疫苗(包括灭活疫苗、腺病毒载体疫苗和dna疫苗)具有不同的保护恒河猴对抗sars-cov-2的作用。灭活疫苗广泛应用于新型传染病的预防，发展速度快，对SARS-CoV-2的预防具有良好的发展前景。值得注意的是，新的证据表明sars-cov感染可能存在抗体依赖性增强(ade)，这表明在开发冠状病毒疫苗时应特别注意安全性评估。
中国首支新冠肺炎灭活疫苗来自国药集团中国生物。国药中国生物技术有限公司4月14日宣布，在对其新型冠状病毒灭活疫苗进行临床试验后，第一阶段临床实践已在河南焦作进行。
【/h/】另一方面，由生物工程研究所陈伟院士、军事科学院军事医学研究所和中国cansino公司联合研制的腺病毒5型(ad5)载体疫苗也取得了很大进展。当地时间5月22日晚，顶级医学杂志《柳叶刀》发表了一篇题为“新冠肺炎疫苗的安全性、耐受性和免疫原性:增加剂量、开放标签、非随机、首次人体试验”的论文。陈伟等研究人员报告了中国健康成人接种ad5载体新冠肺炎疫苗后28天内的一期临床资料，并对疫苗的安全性、耐受性和免疫原性进行了初步评价。
疫苗设计和生产
研究小组从新冠肺炎3名住院患者的支气管肺泡灌洗液标本和咽拭子中分离出3株sars-cov-2毒株，用于建立体外中和攻击sars-cov-2灭活疫苗的临床前动物模型。这3个新冠肺炎菌株是19个ncov-cdc-tan-hb02 (hb02)，19个ncov-CDC-tan-菌株03 (cq01)和19个ncov-CDC-tan-菌株04 (qd01)。这三个菌株分布在进化树的不同位置，表明它们是sars-cov-2的代表。
值得注意的是，所有这些毒株都是从vero细胞中分离出来的，并获得了世界卫生组织的疫苗生产认证。这些vero细胞是被患者咽拭子感染的，而不是其他细胞系，以防止病毒培养和分离过程中可能发生的突变。高效增殖和高遗传稳定性是灭活疫苗发展的关键。他们首先发现，在三种病毒株中，hb02株的88个vero细胞复制效果最好，病毒产量最高(图1a)。因此，研究人员选择hb02株进一步开发灭活sars-cov-2疫苗(bbibp-corv)。hb02株与国内外来源的其他sars cov-2株全基因组序列比较表明，hb02株与其他病毒株同源，证明主要保护性抗原(尖峰蛋白)具有100%的同源性。这表明它有潜力广泛对抗各种sars-cov-2毒株(补充图1和补充图2)。为了获得适合高产的病毒培养基，研究人员纯化了hb02菌株，并在vero细胞中产生了p1病毒培养基。P1培养基用于vero细胞的适应性培养、传代和扩增。研究人员使用经过七代适应的菌株(bj-p-0207)作为疫苗生产的原始种子(bj-p1)。为了评价遗传稳定性，研究人员将其传代三次，获得p10病毒培养基。通过深度测序分析，我们对hb02株和p10株的全基因组进行了测序，结果表明它们的序列同源性为99.95%。此外，在p10病毒的整个序列中，包括弗林的切割位点附近，没有发现氨基酸变异。这些结果表明hb02菌株具有较高的遗传稳定性，有利于进一步开发。
为了高效制造，研究人员基于新的篮式反应器载体建立了bbibp-corv的原料生产策略(图1b)。p7培养基在vero细胞中的生长动力学分析表明，该培养基中的病毒能有效复制，在感染后48-72小时内最高滴度超过7.0 log10 ccid50，感染倍数(moi)为0.01-0.3(图1c)。为了使病毒产物失活，研究人员将丙内酯与收获的病毒溶液在2-8℃下以1∶40的比例混合。三批病毒灭活消除了病毒的传染性，验证了灭活过程的良好稳定性和可重复性(图1d)。蛋白质印迹分析显示疫苗库含有病毒结构蛋白(保护性抗原)(图1e)。阴性染色的电子显微镜图像显示直径约为100纳米的椭圆形病毒颗粒(图1f)。
BBIBP-corv的免疫原性
为了评价bbibp-corv的免疫原性，研究人员采用了不同的免疫方案和不同的剂量(2，4，8μ；G/剂量)注射到balb/c小鼠中。
单剂量免疫组在第0天(d0)腹腔注射三剂，剂量较高(8μ；克/剂)、中(4μ；克/剂)，低剂量(2μ；注射后7、14、21、28天观察中和抗体水平。结果表明，免疫后7天，高、中、低剂量组血清转换率均达到100%，免疫效果呈时间依赖性(图2，补充表1)。低、中剂量组的中和抗体水平在第7、14、21天有显著变化，但在第21、28天无显著差异。在高剂量组中，仅在第7天和第14天观察到显著变化(图2a)。
【/h/】两剂免疫组采用不同的免疫方案(分别在0/7、0/14、0/21天进行免疫)。双剂量免疫高、中、低剂量组血清阳性率在第二次免疫后7天达到100%(图2 b，补充表1)。高、中剂量双剂量免疫程序的免疫原性明显高于单剂量免疫程序。用0天/21天方案进行第二次免疫后7天，中和抗体水平最高。
研究人员还测试了三剂免疫计划的免疫原性。在第0天、第7天和第14天，在小鼠腹腔内接种三剂疫苗，高剂量(8μ；克/剂)、中(4μ；g/剂量)或更低(2μ；g/剂量)疫苗(图2c)。在第7、14、21、28天测定各组中和抗体水平。首次免疫后第7天，三组血清转换率均达到100%(图2c，补充表1)。
【/h/】结果显示，第28天三剂(0天/7天/14天)免疫方案的中和抗体水平高于一剂免疫方案(图2a和2c)。此外，他们分析了用高、中、低剂量疫苗进行单剂量、双剂量(0天/21天)和三剂量(0天/7天/14天)免疫的小鼠的中和抗体水平，并在第一次免疫后28天检测中和抗体水平以保持相同的起点和终点。结果表明，三剂量(0天/7天/14天)免疫程序的免疫原性高于单剂量和双剂量免疫程序(图2d)。
然后他们测量了bbibp-corv在不同动物模型如兔、豚鼠、大鼠和小鼠中的免疫原性。动物用单剂量(d0)(8μ；克/剂)，中剂量(4μ；克/剂)和低剂量(2μ；G/剂量)，并在免疫后21天测量中和抗体水平。结果表明，bbibp-corv具有良好的免疫原性，免疫后21天所有动物模型血清转换率均达到100%(图2 e，补充表1)。在三剂量(0天/7天/14天)免疫组中，食蟹猴、兔、豚鼠、大鼠和小鼠接种高剂量(8μ；g/剂量)(4μ；g/剂量)或更低(2μ；g/剂量)。免疫后21天，所有动物模型血清转换率均达到100%。首次免疫后21天，中和抗体水平显示三剂(0天/7天/14天)免疫程序的高、中、低剂量均高于兔和豚鼠模型的单剂(0天)免疫程序(图2 e 2 f，补充表1)。
非人灵长类动物模型的保护作用
研究小组评估了bbibp-corv对恒河猴的免疫原性和保护作用。
所有恒河猴在第0天(d0)和第14天(d14)免疫两次。安慰剂组肌肉注射生理盐水，两个实验组注射低剂量(2μ；克/剂)或高剂量(8μ；G/剂量)bbibp-corv(图3a)。病毒攻击前，低剂量组和高剂量组的nab gmt分别达到215和256(图3b)。在第24天(第二次免疫后第10天)，所有恒河猴在麻醉下通过气管注射l06 tcid50的sars-cov-2。病毒感染后0 ~ 7天，接种组和安慰剂组的体温在该范围内波动(图3c，补充图4a)。
【/h/】此外，攻击后恒河猴的血清生化参数保持不变(补充图3)，说明bbibp-corv在血清生化参数方面未出现副作用。
【/h/】接下来，研究小组用rt-pcr方法测定了恒河猴咽喉和肛门拭子的病毒载量。结果显示，安慰剂组的所有恒河猴在攻击后的整个评估期内显示并保持高病毒载量(图3d和3e，补充图4b和4c)。
低剂量组恒河猴咽拭子病毒载量在第5天pi时达到峰值(5.33 log10拷贝/ml)，在第7个5dpi时降至1.12 log10拷贝/ml，明显低于安慰剂组。值得注意的是，在低剂量组的4只恒河猴中，有3只在7 dpi时检测不到病毒载量。而高剂量组4只恒河猴咽拭子病毒载量为阴性。此外，在高剂量组的4只恒河猴的2个肛门拭子中未检测到病毒载量。
在7 dpi时，研究小组对所有动物实施安乐死，以确定肺组织中的病毒载量并进行病理检查(图3f和3g)。在低剂量组和高剂量组中，在所有恒河猴的任何肺叶中都没有检测到病毒载量，这与安慰剂组显著不同(图3f)。安慰剂组在左肺、右肺和右副肺检测到高病毒载量，病理分析为严重间质性肺炎。
然而，值得注意的是，安慰剂组的7个肺切片中只有3个被检测到感染。文章指出，这可能是因为病毒在肺叶中的感染是动态的。
【/h/】一般来说，接种bbibp-corv疫苗后，所有恒河猴的肺都是正常的，少数肺叶有局部轻微的组织病理学改变(图3g)，说明接种bbibp-corv疫苗可以有效阻断猴的sars-cov-2感染。
在7 dpi时，用安慰剂处理的恒河猴产生低水平的nab，效价为1:16，而高剂量组的最高水平nab为1:2048(平均1:860)，低剂量组的最高水平nab为1:1024(平均1:512)(图3b)。结果表明，低剂量和高剂量bbibp-corv对恒河猴sars-cov-2有较高的保护作用，未观察到抗体依赖性增强感染。
安全
研究小组首先对sprague-dawley进行了单次肌肉注射实验，以评估bbibp-corv的急性毒性。将20只大鼠分为两组(n=10，5只/性别)，给予3倍剂量的bbi BP-corv(8μ；克/剂，24μ；G/大鼠)和生理盐水作为对照组。接种后继续观察14天，第15天安乐死，进行系统解剖和观察评价。
【/h/】四组大鼠接种后连续14天未死亡或将死亡，未发现明显临床症状。此外，实验组和对照组的体重和喂养状况没有显著差异(图4a，补充图4d)。这些大鼠在安乐死后没有组织病理学变化。
值得注意的是，大鼠单次肌肉注射的最大耐受剂量(mtd)为24μ；G/鼠，相当于人体的900倍。据研究小组称，这表明bbibp-corv对人体具有潜在的良好安全性。
研究小组随后评估了bbibp-corv通过肌肉注射和静脉注射在豚鼠体内引起的全身过敏反应。通过临床观察和豚鼠体重测量，致敏过程中未发现异常反应(图4b)。阴性对照组(生理盐水)和实验组在d19和d26均未发现过敏反应症状。阳性对照组(人血清白蛋白)过敏反应高阳性(1/6只动物阳性，3/6只动物强阳性，2/6只动物极阳性)。与之形成鲜明对比的是，低、高剂量试验组对d19、d26均无过敏反应，过敏反应均为阴性。
研究小组进一步评估了bbibp-corv对恒河猴的长期毒性。将40只恒河猴(20只/性别)分为4组(5只/性别/组)，分别注射生理盐水(组1)或2μ；g、4 & mug、8 & mug bbi BP-corv(2-4组)。每组3只大鼠在d25上解剖，另2只大鼠在d36上解剖进行系统解剖和组织病理学检查。
试验期间，2-4组无死亡或即将死亡，淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD20+、CD3+CD4+/CD3+CD8+)和细胞因子(TNF-α；IFN-&γ；、il-2、il-4、il-5和il-6)、c-反应蛋白或体重，无明显异常的临床生理和病理指标(图4c-4e，补充图4e)。
在D25和d36对安乐死恒河猴的系统解剖没有发现异常。2-4组在d25时出现肉芽肿性炎症，恢复期结束时(d36)仍存在，但较d25略有改善。猕猴仅表现为局部刺激，表现为轻度至重度肉芽肿性炎症，但注射后2周无此反应。8 & muG/剂量组显示未观察到的不良反应水平(noael)。
